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液相色譜柱怎么填料?高效液相色譜柱填料

  液相色譜柱的五大填裝方法
  
  1.高壓勻漿法裝填
  
  2.濕法裝填
  
  3.干法裝填
  
  4.等密度法裝填
  
  5.高粘度法裝填
  
  目前大多數(shù)實驗室是購買商品預(yù)填裝柱來滿足分離、分析之需。液相色譜柱、特別是高效液相色譜柱的填裝,需要有較高的技巧和熟練的技能。因此,有人甚至將“裝柱”看作是“藝術(shù)加技術(shù)”。
  
  但是只要掌握了一些基本的規(guī)律和方法,任何實驗室都可以填裝出具有較高柱性能的色譜柱。
  
  在有關(guān)色譜基本理論的討論中可以得知,發(fā)生在色譜柱中總的譜帶展寬效應(yīng)與流動相的線速度、粒徑以及溶質(zhì)在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)、溶質(zhì)在固定相中的擴(kuò)散系數(shù)等密切相關(guān)。對于給定粒徑的填料來說,能否填充成均勻而緊密的柱床,是得到高性能柱子的關(guān)鍵,而采用粒徑細(xì)且分布均勻的優(yōu)質(zhì)填料,則是得到高性能柱子的最基本保證。
  
  高壓勻漿法裝填
  
  將填料懸浮在適宜的勻漿液中制成勻漿,在其尚未沉降之前,很快以高壓泵將其以很高 的流速壓進(jìn)柱中,便可制備出填充均勻的柱子。這是常見的分析和制備色譜柱的裝填方法。
  
  高壓勻漿法的設(shè)備,如圖所示。

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  裝柱機(jī)的核心是氣動放大泵,通常多設(shè)計放大率為100,即低、高壓柱塞直徑比為10:1,面積比為100:1的氣動放大系統(tǒng)。若低壓端輸入1MPa壓強(qiáng)的壓縮空氣(通??捎脡嚎s空氣鋼瓶供給),則相同的壓力會傳遞至高壓端柱塞上,而高壓柱塞面積僅為低壓端的1/100,因而其輸出壓強(qiáng)亦提高至100MPa。由于氣動放大泵很容易獲得高壓、高流速的輸液,故很適于柱子的填充之需。
  
  在裝柱之前,先確定所用的柱型,以確定選用多大的勻漿罐體積。例如,常用的“標(biāo)準(zhǔn)”HPLC柱為φ4.6mm×250mm,其內(nèi)腔體積約為4.2mL,約需3.5g填料。一般情況下,為保證填充的成功,需適當(dāng)過量15%-20%為宜。如使用4g填料充填它,選擇固 – 液比約為1:10,則勻漿罐體積以4mL為宜。若罐過大,則可在勻漿罐內(nèi)裝入一個以惰性材料(如聚四氟乙烯或不銹鋼)制的襯套將其調(diào)整至所需體積。
  
  將選用的柱子仔細(xì)以乙醇或丙酮清洗干凈,并以干凈的熱風(fēng)吹干。如柱管內(nèi)壁污染較重,也可以用表面活性劑及去離子水依次清洗,并以長竹簽或塑料棒扎上棉紗或紗布往復(fù)抽擦,以除去污垢。但應(yīng)注意不要傷及內(nèi)壁表面的光潔度,尤其不能造成軸向的劃痕。將清潔的柱管的一端裝配上帶濾板的柱頭,另一端則連接至勻漿罐上。
  
  配制勾漿液是高壓勻漿法的重要一環(huán),不同的填料應(yīng)采用不同的勻漿液。不同的文獻(xiàn)和實驗室所報道的勾漿液的種類和比例有所不同。例如,填充硅膠正相柱,可以使用1:1 的氯仿/甲醇;對于C18反相填料,可以使用適宜比例的正己烷4氯仿混合溶劑。若有四溴乙烷等高密度溶劑,也可以以2:1的高密度溶劑與40%的二氧六環(huán)和40%的四氯化碳配成勻漿液。一些實驗室中,常以%*! 的四氯化碳1 二氧六環(huán)配成勻漿液,也可以填充出性能很好的柱子。稱取所需重量的填料,將其置小燒杯中,按其重量的10 倍量(一般也可以按體積計,即10mL的勻漿液中加入1g 重的填料)加入勻漿液。搖動或攪拌均勻后,將其移至超聲波浴中,以中強(qiáng)的超聲波令填料粒子均勻而穩(wěn)定地懸浮起來。最后,再以強(qiáng)超聲短時間強(qiáng)化一下。超聲處理的時間不宜過長,一般應(yīng)不超過2-3min,過長則可能造成顆粒的破碎。
  
  將準(zhǔn)備好的勾漿液立即倒入勻漿罐中,裝滿后,將勻漿罐蓋好、旋緊,再以針筒抽取一定量的勻漿液,從蓋子上的連接孔中插入勻漿罐內(nèi)部并加注勻漿液至從連接孔中溢出為止。這一操作的目的是排除勻漿罐中的空氣泡,空氣泡的存在會妨礙向系統(tǒng)中迅速地施加壓力。抽出注射針并將罐與氣動放大泵的出液管路相連。確認(rèn)連接正確且牢固后,即可開啟放大泵的截門,令貯存于氣動放大泵內(nèi)的頂替液(正相時可以使用氯仿,反相時可使用甲醇)高速壓入罐內(nèi)。
  
  以常見的5μm多孔硅膠填料為例,填裝壓力為50MPa左右(細(xì)孔硅膠可至70MPa)。這里使用的是瞬間升壓的方式,也有文獻(xiàn)報道使用程序加壓。加壓時,勻漿液中的填料滯留于柱尾的濾板上而勻漿液則被排除于柱外。開始時,排出的勻漿液因含部分氣體,釋壓后會逸出而使液體渾濁。待全部勻漿液被排出后,因頂替液黏度較少而流速亦稍加大,且排出液有明顯的外觀上的變化。
  
  此時,可以稍稍降低填充壓力,例如,降至約35MPa,并維持30-40min,然后,在約30min, 內(nèi)逐步將壓力降至常壓。降至常壓后,宜靜置一段時間,例如30min,,以讓柱床內(nèi)的壓力平衡。否則,過早拆卸下已填充的柱子時,會因柱子內(nèi)部的殘余壓力而將柱頭上的填料擠出往外。拆下已填裝好的柱子并裝配上帶有篩板(濾網(wǎng))的柱頭(注意:一定要將沾在柱頭錐套上的填料除凈,否則會影響到柱子的密封性),做好標(biāo)記,即已完成柱子的填裝。
  
  在上述填裝程序中應(yīng)該注意的問題是:
  
  ①高壓操作的安全問題。常發(fā)生的問題是柱子與勻漿罐連接不牢,造成加壓時柱頭被高壓沖下或柱子從勻漿罐上滑脫。此時,輕則填裝失敗,材料損失,重則造成人身傷害事故,一定要加以防范。除每次填裝前均須仔細(xì)確認(rèn)是否連接正確且牢靠外,最好還可加上由法蘭盤和長螺桿組成的預(yù)防脫落裝置,以防萬一。
  
 ?、谕ǔ#忍钛b的柱床較后填裝的柱床緊密。因此,當(dāng)使用時宜以相反的方向為宜,即讓近勻漿罐一端作為使用時流動相的出口,而填裝時的出口端則作為流動相的入口。③新柱子使用前應(yīng)以甲醇沖洗20-30min, 后,再改用流動相平衡。④新柱子宜選適宜的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行評價并記錄,以備存查和比較。
  
  實驗和理論研究均指出,以上述下流式勻漿法難以填裝成長柱子,其原因是,隨著已填充柱床的增高,對流體的阻力亦逐漸增加,使在一定壓力下通過柱床的流速降低,亦即柱床的增長速度變慢,在這一過程中,填料顆粒的沉降亦在進(jìn)行,導(dǎo)致所填充柱床的緊密性和均勻性降低。為保證達(dá)到一定柱效,一次填充的單柱長度不宜過大。有文獻(xiàn)指出,使用6mm內(nèi)徑的柱子,5μm粒徑填料,適宜的單柱柱長為10-15cm。但是近年來,φ4.6×250mm的預(yù)裝柱已被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)柱型,在這樣的柱子上,多能獲得≥80000片/m理論塔板的柱效。
  
  為制取更長的柱子,可以使用上行法(圖12-2-10)。曾有報道,使用3μm 填料,以上行法可以制備長達(dá)1m 的柱子,且其柱效與短柱子相類似。上行法中使用的勻漿液濃度比下行法要小一些,速度也慢一些,因此所填充的柱床相對較均勻。近年來,由于微柱色譜和毛細(xì)管電色譜的發(fā)展,需要填微色譜柱乃至毛細(xì)管色譜柱,而上行法則可以用作為微柱的填充方法之一。

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  濕法裝填
  
  對于高效柱、特別是現(xiàn)在流行的以3-10μm細(xì)柱徑填料填裝的高效分析柱,則必須使用濕法,即勻漿法裝柱。因為,隨著粒徑的縮小,因靜電作用和表面能的加大,粒子間傾向于聚集和“粘結(jié)”,若以干法填裝,它們會粘附在連接管及柱壁上,也會因強(qiáng)烈的靜電作用彼此排斥,因而難以填裝出均勻而緊密的柱床。這樣,必須改以濕法裝填,即將填料懸浮于適宜的液體中消除上述不良作用。但是,在固 – 液系統(tǒng)中仍然存在因重力而引起的沉降現(xiàn)象。

粒子沉降的速度V為

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  式中,g為重力加速度(cm/s2 ),d為粒子直徑(cm),ρ為粒子密度(g/cm3),ρo為液體密度(g/cm3),η為液體的黏度(mPa·s)。從上述公式可知,粒子在液體中的沉降速度,與粒徑直徑的平方以及液 – 固密度之差成正比,而與液體黏度成反比。據(jù)此,濕法填裝可以依阻止沉降的思路分成三種:一條思路是設(shè)法尋找與硅膠密度相近的溶液,以使(ρ-ρ0)減小而降低沉降速度。第二種方法是增加液體的黏度以阻止粒子的下沉。第三種方法是綜合利用前兩種方法,盡力減小沉降并盡快地在發(fā)生較顯著的沉降之前完成裝柱操作。
  
  干法裝填
  
  對于粒徑較大的填料(多用于制備色譜),如粒徑≥20μm的填料,可以用干法裝填,其基本方法與填裝氣相色譜柱類似。但需注意的一點是,在干法填裝制備液相色譜柱時,不要過分劇烈地振動和敲打。振動和敲打會使填料因自身粒徑的不均勻性而產(chǎn)生柱子整體上的不均一性,即較大的填料粒子靠近柱壁,而較細(xì)粒徑者則傾向集中于柱中心。這種柱內(nèi)顆粒分布的不均勻性,會導(dǎo)致柱效的降低。比較好的方法是采用小量多次的方法向柱內(nèi)加入填料,例如每次加入相當(dāng)于3-5mm柱床的填料,裝一點即在實驗臺或桌面上垂直地輕輕磕幾十下,續(xù)加一些填料后,重復(fù)上述操作,直至填裝完成。
  
  等密度法裝填
  
  在HPLC發(fā)展的早期,常采用“等密度法”來填裝高效柱。多孔硅膠的骨架密度較高。例如,LiChrospher 100的表觀密度約為2.3g/cm3,LiChrospher 500 為2.46g/cm3,LiChrospher 1000 為2.49g/cm3。不同牌號的硅膠因制法不同(例如,含有超細(xì)孔和封閉孔者表觀密度小)而有差異,但多在2.2g/cm3以上。因此,需以高密度溶劑配制密度與硅膠骨架密度相近的混合液。常使用的高密度溶劑為碘代和溴代烷類(表12-2-3),再與適當(dāng)比例的其他溶劑相配,配制出具有密度適宜的液體,使填料能呈“失重”狀態(tài)懸浮于勻漿液中,以從容地用高壓泵將其壓入空色譜柱中,制出填裝均勻的高效色譜柱。
  
  在配制上述等密度懸浮液時,除密度外,還要考慮填料的表面狀況與化學(xué)性質(zhì)。如填裝反相柱,應(yīng)選用極性較弱的溶劑,而填充正相柱,如以硅膠為填料時,則應(yīng)選擇極性較強(qiáng)的溶劑,以防止顆粒板結(jié)并保證有良好的潤濕性,以使填料顆粒均勻地分散在勻漿液中。但是,碘代或溴代烷價格昂貴且多數(shù)有較大的毒性,因此,這種方法目前已經(jīng)很少使用。不過,當(dāng)填料粒徑較大,且又難以干法填裝時,等密度法將能發(fā)揮出特殊的作用。

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  表12-2-3 常用于濕法填充的溶劑
  
  高粘度法裝填
  
  高粘度法,即使用黏度較高的勻漿液體系以阻止顆粒的沉降??梢圆捎靡叶肌⒕垡叶?、甘油以及石蠟油等高黏度液體調(diào)配勻漿液。但是,高黏度導(dǎo)致流體阻力加大,必將延長裝柱時間且需使用更高的裝柱壓力,在實用上很不方便。因此,高黏度法已很少被采用。


發(fā)布于: 2023-05-29
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